小脑功能紊乱可导致白天过度嗜睡等睡眠障碍，提示小脑可能参与睡眠和/或觉醒的调节。然而，要理解小脑在睡眠和觉醒状态下的调节特征，需要详细解析该区域神经元活动的特性。通过对小鼠进行多单位记录，我们发现小脑皮层中的浦肯野细胞在睡眠向觉醒转换前表现出增强的放电活动。值得注意的是，这种增强的浦肯野细胞活动源于小脑皮层中低频非浦肯野细胞单位的输入。此外，在非快速眼动睡眠-觉醒转换期间，增强的浦肯野细胞活动伴随着小脑深部核团神经元活动的减弱。我们的研究结果提供了在体电生理学证据，表明小脑具有主动调节睡眠-觉醒转换的潜力。
一、介绍
小脑是中枢神经系统中负责运动规划、运动执行和运动学习的关键组成部分。然而，小脑疾病患者不仅表现出运动障碍，还伴有非运动症状。例如，以进行性小脑变性为特征的脊髓小脑共济失调患者，常出现白天过度嗜睡。此外，去小脑猫表现出觉醒减少和快速眼动睡眠增加。相反，原发性睡眠障碍患者的小脑体积往往减小。总之，现有研究支持"小脑参与调节睡眠和/或觉醒状态"这一假说。
支持该假说的神经解剖学研究显示，作为小脑最终整合与输出核团的小脑深部核团，投射至多个维持或促进觉醒的关键脑区。据报道，小脑深部核团支配参与非快速眼动睡眠向觉醒转换的腹侧丘脑，并与下丘脑存在神经连接——后者是促进觉醒和促进睡眠的多种神经元所在区域。因此，小脑具备与觉醒相关神经元通讯的结构基础，从而调节睡眠和/或觉醒状态。
展开剩余95%然而，只有当小脑活动在各种睡眠/觉醒状态转换前发生变化时，其才可能真正参与调节该过程。因此，监测小脑神经元活动是揭示其在睡眠调节中特定作用与特征的首要步骤。早期研究扩展表明，浦肯野细胞和小脑深部核团神经元在快速眼动睡眠期间放电活动均增强。与此一致，功能成像研究显示不同睡眠阶段小脑活动的变化：例如，人类在非快速眼动睡眠期的小脑活动低于觉醒期，而在快速眼动睡眠期活动增强。但关于睡眠-觉醒转换过程中小脑神经元活动的时序特征，目前仍知之甚少。
因此，本研究通过在小鼠小脑进行跨睡眠-觉醒周期的多单位记录，以探究该过程中小脑神经元活动的时间动力学特征。
二、材料与方法
01.实验动物
所有实验均获得陆军军医大学动物护理委员会的批准。雄性C57/BL6小鼠（n=10，3-5月龄，20g-25g）单笼饲养于12小时光照/12小时黑暗循环环境中（光照起始时间08:00），可自由获取食物和水。所有实验均在光照期进行。
02.外科手术
在异氟烷麻醉（0.6%-1.0%体积浓度，与氧气混合）下，小鼠被植入连接微驱动器的四电极装置。具体植入流程已有文献报道。每根四电极由四根钨丝（裸直径20 μm，绝缘直径25 μm）构成，植入前测得阻抗范围为200-400 kΩ。将一枚不锈钢螺钉穿过颅骨固定于小脑右半球上方作为接地电极，另一枚螺钉固定于新皮层右半球上方作为参考电极，并使用Metbond粘固剂固定。随后，将不锈钢丝植入右侧额叶皮层。同时，在左侧小脑上方开颅，将四电极装置沿纵轴垂直植入（坐标：前囟后6.3 mm，中线旁开1.7 mm），深度达小脑皮层1400-1500 μm。覆盖低粘度硅胶后，术后每日监测小鼠体重直至恢复至术前水平。四电极尖端每日下调约70 μm，直至监测到浦肯野细胞特征性放电。
03.睡眠监测
术后小鼠单笼饲养于透明塑料笼中，适应环境约1周后，于光照期早期开始睡眠监测。
04.在体电生理记录
采用Intan接口板进行数据采集。神经元信号经多路前置放大器放大、以20 kHz采样率数字化，并以16-bit分辨率存储用于离线分析。宽带信号降采样至1250 Hz作为局部场电位。记录期间使用Neuroscope软件实时可视化神经元活动。在8只小鼠中，初始记录定位于浦肯野细胞层附近，以监测睡眠-觉醒周期中的小脑皮层神经元活动。完成末次浦肯野细胞记录后，将四电极下移至少280-490 μm至小脑深部核团区域，次日记录该区域神经元活动。此法可最大限度避免将小脑皮层单位误判为小脑深部核团单位。
05.数据分析
0501.spike分类
单元聚类的详细流程已有文献报道。简言之，从离线高通滤波信号中提取spike，将其波形投影至基于主成分分析的公共基空间。通过KlustaKwik软件半自动聚类与Klusters软件人工聚类相结合的方式进行离线单单元分离。通过验证给定单单元自相关图中存在2ms不规则期（无spike发放）来确保聚类准确性。
0502.睡眠分析
本研究结合额叶皮层局部场电位振荡与小鼠头部运动（反映颈部肌电活动）来界定不同脑状态。该脑状态界定方法已应用于我们近期研究及多个独立研究团队的工作。局部场电位振荡的频谱变化具有高敏感性，可实现秒级时间分辨率的状态转换识别。因此，根据既往研究标准，通过额叶皮层局部场电位振荡与头部运动共同判定非快速眼动睡眠和快速眼动睡眠阶段。从功率谱中自动提取theta/delta比值的K-means聚类结果。非快速眼动睡眠定义为满足以下条件的睡眠时段：(1)小鼠静止不动（速度<0.5 cm/s持续至少10秒）；(2)检测到慢波振荡。快速眼动睡眠则基于皮层theta波（5-10 Hz）与delta波（1-4 Hz）功率比值升高，且单个快速眼动睡眠周期持续至少10秒。
0503.浦肯野细胞的在体电生理学鉴定
根据相关文献标准，浦肯野细胞的鉴定依据其在浦肯野细胞层附近的高频放电活动与特征性复杂spike。候选浦肯野细胞首先通过其强烈自发放电活动进行初筛，随后在单元聚类过程中通过存在简单spike与复杂spike双重放电模式进行确认。复杂spike基于1-3 ms慢波成分及其刻板波形（即单相负向波）进行人工鉴别。对于每个候选浦肯野细胞，需验证复杂spike后存在简单spike发放暂停（>10 ms）。
0504.互相关图量化
参照相关方法， putative兴奋性单突触连接通过互相关图中的短潜伏期峰值进行识别。中心bin前后3 ms范围内的显著峰值（bin宽1 ms）被视为 putative兴奋性单突触连接。当至少一个bin的发放数超过均值99.9百分位数时，该互相关图峰值即判定为显著。均值（对照spike数）计算范围为-50 ms至-10 ms，以控制潜在的低频发放率波动。归一化互相关图通过将观测值除以每bin预期spike数获得。
0505.统计学分析
数据以均值±标准误表示。睡眠与觉醒状态间发放率差异采用配对t检验分析。以转换前-10至-2秒的平均发放率作为对照值，采用配对t检验分析睡眠-觉醒转换过程中的神经元活动变化。根据数据特征选择参数检验或非参数检验方法。所有统计检验以p<0.05为显著性标准。
06.组织学定位
为可视化四电极尖端位置，在所有行为学与电生理记录实验结束时施加电解损伤（直流电流30 μA，持续10秒）。小鼠经戊巴比妥麻醉后，依次灌注生理盐水和4%多聚甲醛固定液。取脑后置于4%多聚甲醛中后固定8小时，随后转入30%蔗糖溶液低温保存48小时。使用冷冻切片机切取20 μm厚冠状切片，收集于磷酸盐缓冲液中备用。切片经DAPI荧光封片剂封片后，在荧光显微镜下观察并采集图像，确认四电极尖端位置。在8只小鼠中，根据浦肯野细胞记录后电极移动增量重建小脑皮层记录位点。
三、结果
01.睡眠-觉醒周期中小脑皮层浦肯野细胞的活动
为了在单神经元水平探究睡眠-觉醒周期中的小脑神经元活动，我们在小脑皮层进行了四电极记录。组织学结果显示，有效记录位点主要位于浦肯野细胞层附近（图1）。所有在体四电极记录均在光照期进行，每次记录的平均时长为139.5 ± 4.9分钟（均值±标准误，n=10只小鼠）。
图1 小脑皮层记录位点的位置。
A DAPI染色的冠状切片，展示小脑皮层中的一个代表性记录位点（虚线圆圈）（比例尺，200 μm）。
B 小脑皮层记录位点的示意图（蓝色圆圈，n = 10）。需要注意的是，在其中8只小鼠中，记录位点是通过从初始皮层记录到最终小脑深部核团记录之间的四电极移动距离估算得出的。
作为小脑皮层的唯一输出神经元，浦肯野细胞整合该区域信息，进而强力调控下游小脑深部核团的神经元活动。因此，我们首先研究了浦肯野细胞在不同睡眠-觉醒状态多次时相中的活动。候选浦肯野细胞最初通过在体状态下其自发的强烈细胞活动进行判定。
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典型的候选浦肯野细胞自相关图呈现显著的中心凹槽（图2A），峰间期直方图呈单峰分布，峰值位于12-30毫秒（图2A）。随后，通过单元聚类过程中存在简单spike和复杂spike（图2B-D）进一步确认候选浦肯野细胞。复杂spike基于1-3毫秒慢波成分及其刻板波形（即宽单相负向波，图2D）进行人工鉴别。每个候选浦肯野细胞均验证了复杂spike后存在简单spike发放暂停（>10毫秒）（图2C, E）。共确定33个候选浦肯野细胞，其平均发放率为38.7 ± 3.9赫兹。
图2 候选浦肯野细胞的在体电生理学分类。
A 两个候选浦肯野细胞的自相关图、平均滤波后波形和峰间期直方图分布。
B 来自浦肯野细胞层的连续记录轨迹。
C 从面板B（红色三角形）中放大的两个简单spike（红色星号）和四个复杂spike（绿色星号）。注意复杂spike后简单spike的暂停。
D B中100个复杂spike（上方面板）和简单spike（下方面板）的叠加波形。
E B中复杂spike（上方面板）和简单spike（下方面板）的自相关图。复杂spike与简单spike之间的互相关图显示，复杂spike发生后简单spike的放电减少。
我们计算了候选浦肯野细胞在各状态下的平均发放率，并比较了其跨状态的量化特征。脑状态通过额叶皮层局部场电位振荡和头/颈部运动共同确定（图3A）。记录中各状态比例与既往报道相似（图3B）。发现候选浦肯野细胞在觉醒期间平均发放率最高（图3A, C），且高活动总是伴随头/颈部运动（图3A上方面板）。统计分析显示，觉醒期浦肯野细胞发放率显著高于非快速眼动睡眠期（t(32) = -3.8725, P < 0.001，配对t检验，n=33，图3C）。此外，快速眼动睡眠期与觉醒期间发放率也存在显著差异（t(32) = -2.7429, P = 0.0099，图3C）。但非快速眼动睡眠与快速眼动睡眠期间发放率无显著差异（t(32) = 0.8262, P = 0.4148，图3C）。考虑到浦肯野细胞呈现多种放电模式，如在非快速眼动睡眠期的规律模式和觉醒及快速眼动睡眠期的爆发样模式（图3A），我们进一步计算了各状态下浦肯野细胞spike的变异系数。发现变异系数随状态的变化与发放率相似（觉醒 vs 非快速眼动睡眠：t(9)=3.937, P=0.004；非快速眼动睡眠 vs 快速眼动睡眠：t(9)=0.094, P=0.927；觉醒 vs 快速眼动睡眠：t(9)=2.333, P=0.048，配对t检验，n=10只小鼠；图S1A）。
图3 候选浦肯野细胞在不同状态下的放电活动。
A 高通滤波轨迹显示单个候选浦肯野细胞在觉醒（上方面板）、非快速眼动睡眠（中间面板）和快速眼动睡眠（下方面板）状态下的代表性放电。状态通过额叶皮层的局部场电位和头/颈部运动共同确定。
B 记录期间处于觉醒、非快速眼动睡眠或快速眼动睡眠状态的时间百分比，数据来自10只小鼠的平均值。数据以均值±标准误表示。
C 候选浦肯野细胞（n=33）在各状态下的平均发放率。
**P < 0.01；***P < 0.001；n.s. 无显著差异。
此外，与既往在体电生理研究相似，我们记录到候选浦肯野细胞的复杂spike平均发放率为1.05 ± 0.09赫兹（n=33）。但复杂spike发放率在各状态间无显著变化（觉醒 vs 非快速眼动睡眠：t(32)=0.7363, P=0.5168；非快速眼动睡眠 vs 快速眼动睡眠：t(32)= -0.7117, P=0.6333；觉醒 vs 快速眼动睡眠：t(32)=0.2357, P=0.8358），提示攀缘纤维输入不太可能是影响状态转换的主要信号源。
研究表明，浦肯野细胞活动的变化快速且时间精确，参与觉醒状态下运动行为的精确执行和纠错。因此，我们进一步探究了状态转换期间浦肯野细胞活动是否发生快速动态变化。根据近期研究标准，我们发现候选浦肯野细胞的放电活动在从非快速眼动睡眠向觉醒转换时显著增加（t(32)= -2.8529, P=0.0075，配对t检验，n=33，图4A, B），其中15/33个细胞在觉醒期的活动高于非快速眼动睡眠期（图4C）。值得注意的是，在这些活动增强的浦肯野细胞中，从放电增加到觉醒开始的平均潜伏期为2.2 ± 0.5秒（n=15）。相反，当小鼠入睡时，候选浦肯野细胞的放电活动减少（t(32)=2.547, P=0.0159，配对t检验，n=33，图4D, E），其中9/33个细胞在非快速眼动睡眠期的活动低于觉醒期（图4F）。从放电减少到非快速眼动睡眠开始的潜伏期为3.4 ± 0.4秒（n=9）。此外，候选浦肯野细胞在从快速眼动睡眠向觉醒转换时活动趋于增加（t(32)= -2.5262, P=0.0167，配对t检验，n=33，图4H, I），平均潜伏期为1.6 ± 0.4秒。我们还绘制了每个浦肯野细胞的非快速眼动睡眠-觉醒调节指数（FNREM - Fwake)/(FNREM + Fwake)与快速眼动睡眠-非快速眼动睡眠调节指数（FREM - FNREM)/(FREM + FNREM)的关系图，其中F为各状态下的平均发放率。浦肯野细胞的非快速眼动睡眠-觉醒调节指数呈现以0.06为中心的单峰分布（图S1B），对应于觉醒状态。相比之下，浦肯野细胞的快速眼动睡眠-非快速眼动睡眠调节指数呈现以-0.08为中心的双峰分布（图S1B），其峰值对应于快速眼动睡眠-off状态。这些结果提示浦肯野细胞既是觉醒-on神经元，也是快速眼动睡眠-off神经元。相比之下，在非快速眼动睡眠向快速眼动睡眠（t(32)= -0.1442, P=0.8862，配对t检验，n=33，图S2A）或快速眼动睡眠向非快速眼动睡眠转换时（t(32)= -1.5295, P=0.136，图S2B），浦肯野细胞活动无显著变化。综上所述，我们的结果证明内源性候选浦肯野细胞活动特异性地与从睡眠到觉醒的状态转换相关，并发生在该转换之前。
图4 候选浦肯野细胞活动在状态转换时的动态变化。
A 代表性局部场电位功率谱和头/颈部运动轨迹，展示非快速眼动睡眠-觉醒转换过程。
B 在从非快速眼动睡眠向觉醒转换前，候选浦肯野细胞放电活动增加（n = 33）。
C 对非快速眼动睡眠-觉醒转换表现出增加、减少或微小反应的浦肯野细胞的比例。
D 代表性局部场电位功率谱和头/颈部运动轨迹，展示觉醒-非快速眼动睡眠转换过程。
E 在从觉醒向非快速眼动睡眠转换前，候选浦肯野细胞放电活动减少（n = 33）。
F 对觉醒-非快速眼动睡眠转换表现出增加、减少或微小反应的浦肯野细胞的比例。
G 代表性局部场电位功率谱和头/颈部运动轨迹，展示快速眼动睡眠-觉醒转换过程。
H 在从快速眼动睡眠向觉醒转换前，候选浦肯野细胞放电活动增加（n = 33）。
I 对快速眼动睡眠-觉醒转换表现出增加、减少或微小反应的记录到的浦肯野细胞的比例。
在A、D和G中，色阶表示原始功率谱密度的功率（mV²）；数据以均值±标准误表示；在B、E和H中，阴影区域表示标准误。
02.睡眠-觉醒周期中小脑皮层的非浦肯野细胞单位活动
浦肯野细胞的放电活动受到小脑皮层中颗粒细胞和中间神经元等非浦肯野细胞单位输入的调节。因此，我们评估了各状态下非浦肯野细胞单位的放电活动。在10只小鼠中，我们记录并聚类了42个非浦肯野细胞单位，其平均发放率相对较低，为3.9 ± 0.1赫兹。非浦肯野细胞单位的发放率显著低于候选浦肯野细胞（Z = 7.2312, P < 0.001，Wilcoxon秩和检验）。此外，这些非浦肯野细胞单位中未发现复杂spike。与浦肯野细胞相似，非浦肯野细胞单位也表现出脑状态依赖性活动（图5A）。值得注意的是，非浦肯野细胞单位的最低放电活动出现在非快速眼动睡眠期（非快速眼动睡眠 vs 觉醒：t(41)= -3.1404, P=0.0031；非快速眼动睡眠 vs 快速眼动睡眠：t(41)= -3.7565, P < 0.001，配对t检验，n=42，图5A）。相比之下，觉醒期与快速眼动睡眠期的发放率无显著差异（t(41)= -1.4469, P=0.1555，图5A）。
图5 非浦肯野细胞单位活动在状态转换时的动态变化。
A 非浦肯野细胞单位在各状态下的平均发放率（n = 42）。数据以均值±标准误表示（**P < 0.01，***P < 0.001，n.s.，无显著差异）。
B 快速眼动睡眠-非快速眼动睡眠活动差异与觉醒-非快速眼动睡眠活动差异的关系图。每个符号代表一个神经元（n = 42个单位，来自10只小鼠）。
C 在从非快速眼动睡眠向觉醒转换前，非浦肯野细胞单位放电活动增加（n = 42）。
D 对非快速眼动睡眠-觉醒转换表现出增加、减少或微小反应的非浦肯野细胞单位的比例。
E 在从觉醒向非快速眼动睡眠转换前，非浦肯野细胞单位放电活动减少（n = 42）。
F 对觉醒-非快速眼动睡眠转换表现出增加、减少或微小反应的非浦肯野细胞单位的比例。
G 在从快速眼动睡眠向觉醒转换时，非浦肯野细胞单位的放电活动（n = 42）。
H 对快速眼动睡眠-觉醒转换表现出增加、减少或微小反应的非浦肯野细胞单位的比例。
在C、E和G中，数据以均值±标准误表示（阴影区域表示标准误）。
同样，我们绘制了非浦肯野细胞单位的非快速眼动睡眠-觉醒调节指数与快速眼动睡眠-非快速眼动睡眠调节指数的关系图。非浦肯野细胞单位的非快速眼动睡眠-觉醒调节指数呈现以0.18为中心的单峰分布（图5B），对应于觉醒状态。此外，非浦肯野细胞单位的快速眼动睡眠-非快速眼动睡眠调节指数也呈现以0.17为中心的单峰分布（图5B），其峰值对应于快速眼动睡眠状态。这些结果提示小脑皮层的非浦肯野细胞单位既是觉醒-on活跃，也是快速眼动睡眠-on活跃。
接下来，我们记录了非浦肯野细胞单位在各种状态转换期间的活动，发现其活动在非快速眼动睡眠向觉醒转换时显著增加（t(41)= -2.4886, P=0.0170，配对t检验，n=42，图5C），其中24/42个细胞在觉醒期的活动高于非快速眼动睡眠期（图5D）。在这些活动增强的非浦肯野细胞单位中，从放电增加到觉醒开始的平均潜伏期为0.0 ± 0.6秒（n=24）。相反，当小鼠入睡时，非浦肯野细胞单位的放电活动减少（t(41)=3.9863, P < 0.001，配对t检验，n=42，图5E），其中24/42个细胞在非快速眼动睡眠期的活动低于觉醒期（图5F）。从放电减少到非快速眼动睡眠开始的潜伏期为1.4 ± 0.9秒（n=24）。与候选浦肯野细胞不同，非浦肯野细胞单位在从快速眼动睡眠向觉醒转换时活动并未增加（t(41)= -0.0319, P=0.9747，配对t检验，n=42，图5G, H）。同样，在非快速眼动睡眠向快速眼动睡眠或快速眼动睡眠向非快速眼动睡眠转换时，其活动也无显著变化（均P > 0.05，配对t检验，n=42）。总之，这些结果表明非浦肯野细胞单位的活动随脑状态变化，尤其在觉醒和快速眼动睡眠状态中活跃。
浦肯野细胞和非浦肯野细胞表现出相似的脑状态依赖性活动，提示它们之间存在相互作用。为验证这一可能性，我们利用同时记录的非浦肯野细胞和浦肯野细胞之间的spike互相关（以非浦肯野细胞spike时间为t=0），计算了非浦肯野细胞与浦肯野细胞之间的兴奋性单突触连接（非浦肯野细胞-浦肯野细胞对）。我们从同一四电极记录的神经元群中检测到单突触连接的神经元对（图6A）。值得注意的是，候选浦肯野细胞倾向于在非浦肯野细胞放电后放电（图6A）。在19个互相关图中，7个（36.8%）具有短潜伏期（<3毫秒）和单峰峰值（图6B），表明存在从非浦肯野细胞到浦肯野细胞的单突触输入。确实，非浦肯野细胞spike后短潜伏期（<3毫秒）内浦肯野细胞放电的概率显著高于非浦肯野细胞之间（Z=2.113, P=0.0346，Wilcoxon秩和检验，图6C, D）。这些结果表明，在睡眠-觉醒周期中，非浦肯野细胞与浦肯野细胞之间存在显著的相互作用。
图6 非浦肯野细胞单位与浦肯野细胞之间的单突触连接。
A 原始轨迹显示小脑皮层的四电极记录（通道1-4）。下方的高通滤波轨迹显示通道2中同时记录的非浦肯野细胞和浦肯野细胞单位。值得注意的是，候选浦肯野细胞（红色）倾向于在非浦肯野细胞单位（蓝色）放电后的3毫秒时间窗内放电。
B A图中所示非浦肯野细胞单位（蓝色）与浦肯野细胞单位（红色）的自相关图和互相关图。
C 非浦肯野细胞-浦肯野细胞对（n=19）和非浦肯野细胞-非浦肯野细胞对（n=40）的归一化互相关图。
D 非浦肯野细胞与浦肯野细胞之间兴奋性单突触连接的概率显著高于非浦肯野细胞单位之间。
数据以均值±标准误表示（*P < 0.05）。
03.睡眠-觉醒周期中小脑深部核团的神经元活动
小脑深部核团是小脑的最终输出结构，投射至多个对促进或维持觉醒至关重要的脑区。此外，其放电活动受到浦肯野细胞抑制性输入的强力调控。因此，我们进一步探究了小脑深部核团单位的放电是否受到浦肯野细胞跨不同状态放电活动变化的影响。为此，我们在8只小鼠中将四电极从浦肯野细胞层附近下移至小脑深部核团。小脑深部核团的记录位点经事后组织学验证（图7A, B）。我们共记录并聚类了21个小脑深部核团单位。小脑深部核团单位的平均发放率为25.8 Hz ± 5.1 Hz，范围从2.7 Hz到94.9 Hz。平均而言，在觉醒期和非快速眼动睡眠期，小脑深部核团神经元的发放率均显著低于浦肯野细胞（觉醒期：Z = -2.3067, P = 0.0211；非快速眼动睡眠期：Z = -2.2002, P = 0.0278，Wilcoxon秩和检验）。
尽管不同状态间的平均发放率无显著差异（P > 0.05，图S3A），但统计分析显示，在从非快速眼动睡眠向觉醒转换时，小脑深部核团单位的放电活动降低（t(20) = 2.1770, P = 0.0416，配对t检验，n=21，图7C），其中9/21个细胞在觉醒期的活动低于非快速眼动睡眠期（图7D）。在这些单位中，从放电减少到觉醒开始的平均潜伏期为2.0 ± 0.7秒（n=9）。同样，在从快速眼动睡眠向觉醒转换时，小脑深部核团单位的放电活动趋于降低，但未达到显著性水平（t(20) = 1.8572, P = 0.0781，图7E, F）。此外，在觉醒向非快速眼动睡眠（t(20) = -0.8008, P = 0.4326，配对t检验，n=21，图7G, H）、非快速眼动睡眠向快速眼动睡眠（P > 0.05，图S3B, C）以及快速眼动睡眠向非快速眼动睡眠转换时（P > 0.05，图S3D, E），放电活动均无显著变化。这些结果表明，与浦肯野细胞放电的变化一致，下游的小脑深部核团单位在放电活动上也表现出显著变化，尤其是在从非快速眼动睡眠向觉醒的转换过程中。
图7 小脑深部核团单位活动在状态转换时的动态变化。A DAPI染色的冠状切片显示小脑深部核团中的一个代表性记录位点（箭头所示；比例尺，200 μm）。B 小脑深部核团记录位点的示意图（红色圆圈，n = 8只小鼠）。C 在从非快速眼动睡眠向觉醒转换前，小脑深部核团单位放电活动降低（n = 21）。D 对非快速眼动睡眠-觉醒转换表现出增加、减少或微小反应的小脑深部核团单位的比例。E 在从快速眼动睡眠向觉醒转换时，小脑深部核团单位的放电活动（n = 21）。F 对快速眼动睡眠-觉醒转换表现出增加、减少或微小反应的小脑深部核团单位的比例。G 在从觉醒向非快速眼动睡眠转换时，小脑深部核团单位的放电活动（n = 21）。H 对觉醒-非快速眼动睡眠转换表现出增加、减少或微小反应的小脑深部核团单位的比例。数据以均值±标准误表示（C、E和G中阴影区域表示标准误）。
四、讨论
为确定小脑在睡眠与觉醒调节中的具体作用，必须检测该过程中小脑神经元单位的活动模式。为此，我们对自然睡眠小鼠进行了在体多单位记录，发现小脑皮层中的浦肯野细胞在从睡眠向觉醒转换前表现出显著增强的放电活动。此外，增强的浦肯野细胞活动源于小脑皮层中低频放电的非浦肯野细胞单位的输入。在抑制性浦肯野细胞的下游，小脑深部核团神经元在从非快速眼动睡眠向觉醒转换过程中表现为放电减少。我们的研究结果，结合关于小脑-下丘脑和小脑-腹侧丘脑回路的信息，凸显了小脑积极参与调节睡眠和觉醒的时间特征。
长期以来，人们已知小脑对运动规划、运动执行和运动学习至关重要。近年来，它也被涉及多种非运动功能，如认知、奖赏、社交行为、空间学习和恐惧条件化。除这些非运动功能外，我们在此展示小鼠小脑神经元在睡眠-觉醒周期中表现出状态依赖性活动。特别是，小脑神经元放电的变化发生在状态转换之前。因此，小脑可能通过与腹侧丘脑和下丘脑中的觉醒神经元相互作用，成为调节睡眠和/或觉醒状态的新候选脑区。支持这一假说，睡眠障碍在小脑变性患者中很常见。同样，去小脑猫常出现睡眠增加。
先前结合功能磁共振成像和脑电图记录的研究表明，非快速眼动睡眠期间的小脑活动低于觉醒期间。相对于成像技术，侵入性多单位记录能够以更高的时间分辨率和细胞特异性记录小脑的单神经元活动。在本研究中，我们根据放电特征将小脑皮层单位分为候选浦肯野细胞和非浦肯野细胞。值得注意的是，我们发现候选浦肯野细胞和非浦肯野细胞均在从非快速眼动睡眠向觉醒转换前增加了活动。此外，我们的结果揭示增强的浦肯野细胞活动源于非浦肯野细胞的输入。与此一致，两种类型的神经元在从睡前期觉醒向非快速眼动睡眠转换过程中放电活动均减少。因此，我们的结果不仅与人类受试者的功能成像发现相似，而且揭示了非快速眼动睡眠-觉醒转换期间小脑皮层激活的细胞机制。有趣的是，小脑皮层单位在非快速眼动睡眠与快速眼动睡眠或快速眼动睡眠与非快速眼动睡眠状态之间的转换过程中并未发生显著的放电变化，表明小脑皮层可能参与特定状态之间的转换。然而，未来需要使用Cre依赖的光遗传学或化学遗传学操作的实验。这些实验可以揭示小脑皮层中特定神经元活动的调控，从而确定其在调节睡眠-觉醒转换中的作用。
先前研究表明，浦肯野细胞和小脑深部核团神经元的活动在快速眼动睡眠期间增加。相比之下，我们在此发现浦肯野细胞的活动在快速眼动睡眠期间减少。考虑到浦肯野细胞的放电活动与运动和肌张力密切相关，可以合理推断我们目前的结果与快速眼动睡眠期间肌张力丧失的情况相符。结合浦肯野细胞活动的时间动力学，我们推测浦肯野细胞可能通过放电活动的变化（而非平均发放率）参与状态转换。然而，这种推测需要通过检验是否能通过快速光遗传学操控浦肯野细胞来诱导状态转换进行验证。
在小脑皮层记录到的非浦肯野细胞的平均发放率与既往在体电生理研究的结果相似。考虑到小脑皮层中绝大多数神经元是兴奋性颗粒细胞，我们的结果很可能揭示了状态转换期间颗粒细胞活动的变化。但是，我们不能排除其他非浦肯野细胞（如抑制性高尔基细胞和/或篮状细胞）出现不同放电模式的可能性。事实上，如图5C, D所示，非浦肯野细胞在非快速眼动睡眠向觉醒转换过程中表现出活动增加（57%）和减少（17%）。因此，这一结果引出了这样的解释：两种类型的非浦肯野细胞（兴奋性颗粒细胞和抑制性高尔基细胞）可能都参与状态转换。
本研究中，候选浦肯野细胞（2.2 ± 1.8秒）和非浦肯野细胞（0.0 ± 2.7秒）到状态转换的潜伏期存在差异。这个结果似乎与我们提出的图6所示的非浦肯野细胞到浦肯野细胞存在单突触输入的观点相矛盾。然而，应注意只有36.8%的非浦肯野细胞与浦肯野细胞存在单突触输入。此外，我们发现非浦肯野细胞在非快速眼动睡眠向觉醒转换过程中放电活动既有增加也有减少，表明非浦肯野细胞放电的复杂性。此前已有研究揭示小脑皮层含有大量颗粒细胞，它们受邻近高尔基细胞的抑制。此外，高尔基细胞的活动可间接受到浦肯野细胞的影响。因此，可以预期，颗粒细胞和高尔基细胞共同的输入可能导致非浦肯野细胞产生复杂的放电模式，其到状态转换的潜伏期具有较大方差（± 2.7秒）即为证明。
响应于浦肯野细胞放电的增加，下游的小脑深部核团单位在从非快速眼动睡眠向觉醒转换过程中表现出显著降低的放电活动。解剖学上，作为小脑的最终整合和输出结构，小脑深部核团与多个与睡眠-觉醒相关的区域存在强且相互的连接。因此，神经元活动的变化使小脑深部核团能够参与非快速眼动睡眠-觉醒转换。这一观点得到间接证据的进一步支持：激活小脑深部核团下游区域之一的腹侧丘脑，可诱导从非快速眼动睡眠向觉醒的快速状态转换。然而，未来需要研究直接激活腹侧丘脑中的小脑深部核团末梢是否对非快速眼动睡眠-觉醒转换有类似效应。
还应注意的是，在从快速眼动睡眠向觉醒转换过程中，小脑深部核团神经元活动无显著变化，暗示整个小脑不太可能参与快速眼动睡眠-觉醒转换的调节。支持这一观点的是，激活腹侧丘脑并不能促进从快速眼动睡眠向觉醒的转换。然而如前所述，浦肯野细胞的放电活动在从快速眼动睡眠向觉醒转换过程中增加，这与运动有关。因此，下游小脑深部核团神经元活动为何保持相对稳定仍是一个问题。
已有证据积累表明，小脑深部核团至少包含三个亚群：谷氨酸能、γ-氨基丁酸能和甘氨酸能细胞。特别是，谷氨酸能小脑深部核团神经元受其γ-氨基丁酸能邻域的抑制。在本研究中，我们预期浦肯野细胞活动增强会抑制小脑深部核团中的下游神经元。同时，受抑制的γ-氨基丁酸能小脑深部核团细胞可以对谷氨酸能小脑深部核团神经元去抑制。我们推测，这两种对谷氨酸能小脑深部核团神经元产生的相反效应，在一定程度上可能导致小脑深部核团整体活动无变化。此外，已有研究表明，兴奋性神经调质乙酰胆碱在快速眼动睡眠期间释放于小脑，这可能拮抗了从快速眼动睡眠向觉醒转换过程中浦肯野细胞对小脑深部核团细胞的抑制效应。
本研究旨在提供电生理学证据，证明小脑具有调节睡眠-觉醒转换的潜力。我们揭示了小鼠小脑单神经元活动的时间特征，这对于确定小脑是否以及如何积极参与调节睡眠-觉醒转换至关重要。已有证据积累表明，小脑通过与大脑皮层、海马、脑桥核及其他皮层下区域的连接，参与多种非运动功能。在本研究中，我们聚焦于大脑小脑，因为睡眠和觉醒与大脑皮层的活动密切相关。然而，未来需要实验来检验每个小脑区域在不同睡眠阶段的放电模式是否表现出相似的时空模式。
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